Praktikum am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg
vom 4. bis zum 14. Oktober 2016
Von Lena Kruse und Anna-Lena Pollmann

Im Rahmen der Auricher Wissenschaftstage wurde uns, Lena Kruse und Anna-Lena Pollmann, die Möglichkeit geboten, in den Herbstferien, vom 4. bis zum 14. Oktober 2016, ein Praktikum am Max-Planck-Institut von Prof. Dr. Thomas Jenuwein zu absolvieren.

Das Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg ist eine Forschungseinrichtung, die sich mit den zwei Schlüsselbereichen der modernen Biologie befasst: Immunbiologie und Epigenetik.

Immunbiologie untersucht die Wege, mit denen mehrzellige Organismen sich gegen Pathogene (Viren und Bakterien) verteidigen. Dieses Wissen führt zur Verbesserung der Diagnose und zur Behandlung von Immundefizienz und entzündlichen Erkrankungen.

Epigenetik ist die Erforschung vererbbarer Eigenschaften, die nicht durch Veränderungen der zugrunde liegenden DNA-Sequenz entstehen. Epigenetische Mechanismen sind grundlegend für die Organisation und Nutzung unserer genetischen Information. Da die Anfälligkeit für Erkrankungen durch epigenetische Fehlfunktionen gefördert werden kann, haben epigenetische Fehlfunktionen weitreichende Auswirkungen auf Diagnose und Therapie humaner Erkrankungen.

Im Institut sind zurzeit 345 Mitarbeitern in 14 Forschungsgruppen tätig, die durch modernste wissenschaftliche Infrastruktur unterstützt werden. Die Kommunikation findet hier überwiegend auf Englisch statt, da viele Forscher aus verschiedenen Nationen vertreten sind. Während des Praktikums unterhielten wir uns ebenfalls mit den Forschern auf Englisch. In einer der Forschungsgruppen mit dem Schwerpunkt Epigenetik durften wir zwei Wochen lang unter der Leitung der polnischen Forscherin Kalina Swist-Rosowska und dem kanadischen Forscher Reagan Ching den Alltag eines Laboranten erleben.

Kalina, Lena, Anna-Lena, Regan (v. l.)
Unser Arbeitsplatz

Nach einer Laborführung gab uns Kalina, die für diese Woche unsere Ansprechpartnerin war, einen Einblick in den Praktikumsablauf.

Unser erstes großes Projekt war die Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), die zum Nachweis von DNA- und RNA-bindenden Proteinen dient. Dabei werden DNA-Protein-Komplexe nach Größe voneinander getrennt. Die größeren Komplexe befinden sich weiter oben im Gel, kleinere Komplexe bzw. ungebundene DNA befindet sich am Boden des Gels.

Wir spezialisierten uns dabei auf die Nukleoproteine MBD2 und MeCP2. Diesen Versuch führten wir eigenständig durch. Für Fragen standen uns die Forscher immer zur Verfügung.

Zuerst stellten wir eine Farblösung (DNA-Dye) her, die DNA-Protein-Komplexe sichtbar macht. Außerdem zeigt die Farblösung, wie weit die Elektrophorese vorangeschritten ist.

Scannen eines Polyacrylamidgels nach der Gelelektrophorese
Pipettieren der Lösung

Des Weiteren stellten wir ein Polyacrylamidgel her. Die Herstellung nach vorgegebener Rezeptur erforderte präzises Arbeiten mit einer Pipette, welches zunächst Übung brauchte. Die Besonderheit des Polyacrylamidgels ist es, dass die Porengröße durch Konzentrationsveränderung des Acrylamids in der Herstellung beeinflusst werden kann und damit dem jeweiligen Trennproblem angepasst wird.

Die von uns gefüllten Kassetten mit dem flüssigen Polyacrylamid wurden unter Strom gesetzt, dieses wird Elektrophorese genannt.

Parallel dazu bereiteten wir Bindungsreaktionen vor. Unsere Aufgabe war es, eine Verdünnungsreihe von unseren zu untersuchenden Proteinen MBD2 und MeCP2 herzustellen.

Zu den hergestellten Verdünnungsreihen pipettierten wir eine Pufferlösung und verschiedene Typen von DNA bzw. RNA (Hybride, methylierte DNA bzw. RNA, etc.) von einer Maus. Die Lösung wurde anschließend von uns auf das Polyacrylamidgel übertragen und ein weiteres Mal unter Strom gesetzt (Elektrophorese).

Bevor wir den Versuch analysieren konnten, benötigten wir einen Scan des Polyacrylamidgels nach der Elektrophorese. Durch diesen wird eine „fraction bound“ sichtbar, die angibt, wie hoch die Affinität zwischen den Bindungspartnern ist. Komplexe aus beispielsweise DNA und Protein befinden sich im oberen Teil des Gels, da sie das Polyacrylamidgel nicht passieren können.

Am Ende der Woche konnten wir schließlich mit Kalina die Auswertung vornehmen. Nach sieben Tage Forschung haben wir unser erstes Projekt mit vielen spannenden Eindrücken beendet und freuten uns auf die nächste Woche.
Durch die zweite Woche begleitete uns dann Reagan Ching, ein kanadischer Forscher, der zurzeit seinen Ph. D. in Deutschland macht. Dieser ist zu vergleichen mit einem deutschen Doktortitel und bezeichnet den wissenschaftlichen Doktorengrad in englischsprachigen Ländern.

Mit ihm führten wir zwei Experimente durch, den Western Blot und die IF.

Proteinbanden auf einer Trägermembran

Mit dem Western Blot wollten wir herausfinden, welche Proteine sich an der DNA befinden. Dabei führten wir wieder eine Gelelektrophorese durch. Wie schon bei der EMSA durchlaufen die Proteine das Polyacrylamidgel und werden nach ihrer Größe aufgetrennt. Die kleineren Proteine befinden sich in dem oberen Bereich des Gels, die größeren im unteren Bereich.

Nach der Beendigung des Laufes wird das Gel mit den Proteinen auf eine künstliche Trägermembran übertragen und mit einem Antikörper versetzt.

Da dieser mit einem fluoreszierenden Farbstoff versetzt ist, können die sogenannten Proteinbanden sichtbar gemacht werden. Dieser Prozess ist lichtempfindlich; so mussten wir immer mit Alufolie und lichtgeschützten Reagenzgläsern arbeiten und die Ergebnisse in einer Kassette aufbewahren, die ebenfalls gegen Licht geschützt war. Auch die anschließende Auswertung fand im Dunkeln statt. In einer Dunkelkammer konnten wir unsere Ergebnisse dann mit einer speziellen Maschine ausgewerten. Dazu wird das Ergebnis auf eine spezielle Folie gedruckt.

Dieser Versuch begleitete uns bis zum Dienstagmittag, bevor wir uns an den dritten und letzten Versuch wagten: Die Immunfluoreszenz, auch IF abgekürzt. Es ist eine Methode zur Sichtbarmachung von verschiedenen Zellen.

Hierbei schauten wir uns unter einem Mikroskop Mäusezellen an. Wir benutzten Zellen von Mäusen, da sie dem Aufbau einer menschlichen Zelle sehr ähneln, jedoch schneller wachsen. Außerdem seien Menschenversuche verboten, erklärte uns Reagan.

Die Zellen, die wir benutzten, wurden im Labor extra für diesen Versuch präpariert und gezüchtet. Hierbei gab es zwei Typen. Einige wurden mit einem Inhibitor gezüchtet, der eine hemmende Wirkung besitzt. Die anderen wuchsen ohne Inhibitor auf.

Anhand dieser beiden Typen wollten wir herausfinden, wie Antikörper die Gene und die DNA verändern. Dazu fügten wir der Zelle erst einmal einen Farbstoff namens DAPI hinzu. Dieser verlieh unseren Zellen eine auffallende Farbe, sodass wir diese unter dem Mikroskop erkennen konnten. Außerdem machte sie die DNA-Stränge in Form von Punkten sichtbar.

Als zweiter Stoff wurde H3K9me1 hinzugefügt. Es ist ein Antikörper, dessen Wirkung wir untersuchen wollten. Er ist an einen anderen Farbstoff gekoppelt, damit man Unterschiede besser feststellen kann. Das Besondere daran ist hier, dass man den Farbstoff nur unter einem bestimmten Licht sehen kann.

Mikroskop
Ein Blick durch das Mi­kroskop

Nachdem wir die Zelllösung mit dem Farbstoff und dem Antikörper vermischt hatten, wurde diese auf Objektträger übertragen und wir konnten anfangen zu mikroskopieren. Dieses war sehr erstaunlich, da keiner von uns je mit einem so großen Mikroskop gearbeitet hatte. Reagan erklärte uns jedoch sehr detailliert die Vorgehensweise und schon nach kurzer Zeit konnten wir selber mit dem Mikroskop arbeiten.

Hierbei sollten wir passende Bildausschnitte finden, die viel über den Zustand der einzelnen Zellen sagen können, also besonders viele Zellen oder auch besonders große. Wenn wir einen passenden Ausschnitt gefunden hatten, wurde eine Art Foto mit verschiedenen Beleuchtungen gemacht. Erst sieht man die Zellen ohne den Antikörper, bei dem zweiten mit dem Antikörper.

Insgesamt wurden 15 Aufnahmen gemacht, die wir am nächsten Tag analysieren durften. Dazu zählten wir erst die gesamten Zellen aus dem Ausschnitt. Danach nahmen wir uns die gleiche Aufnahme vor, diesmal aber mit dem anderen Licht, das den Antikörper zeigt. Hier zählten wir nun alle Zellen, deren DNA noch zu erkennen war, also deren Gene noch aktiv waren.

Leider konnten wir nicht das gewünschte Ergebnis erzielen; somit beendeten wir den Versuch mit offenem Ergebnis. Dieser Misserfolg brachte uns jedoch noch ein einmal den Alltag eines Laboranten näher. Auch Reagan betonte, dass seine Arbeit aus 90% Misserfolgen bestehe, dies aber wichtig sei, um die Forschung weiter zu bringen.

Trotz Misserfolgen standen uns Kalina, Reagan und der Rest des Teams stets zur Seite und halfen uns bei all unseren Problemen und Fragen. So konnten wir unser Praktikum dennoch erfolgreich abschließen und viele Erfahrungen und Ratschläge für unsere Zukunft mitnehmen. Durch dieses Praktikum wurde uns eine einmalige Chance ermöglicht, Menschen aus aller Welt kennenzulernen und ihnen bei der Arbeit zuzuschauen und vor allem uns auch selbst auszuprobieren.

Somit möchten wir uns vor allem bei den Organisatoren und dem Förderverein der Auricher Wissenschaftstage und dem Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg für das tolle und vor allem sehr lehrreiche Praktikum bedanken.

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